Indomethacin 95

+

La constatation que les tissus tumoraux humains et animaux contiennent des niveaux accrus de prostaglandines ont stimulé la recherche expérimentale et clinique, ce qui démontre que les AINS peuvent réduire l'incidence des tumeurs (pour revue voir Taketo, 1998a, b). Dans plusieurs modèles de rongeurs pour le cancer colorectal, les AINS indométhacine, l'aspirine, le sulindac et le piroxicam ont été montrés pour réduire la croissance tumorale. Les résultats des études sulindac-administration chez les patients FAP et des études épidémiologiques chez les patients traités avec des doses élevées d'aspirine ou d'autres AINS ont confirmé les effets suppresseurs de tumeurs (pour revue, voir DuBois et Smalley, 1996; Levy, 1997). Un grand nombre des effets thérapeutiques des AINS sont clairement dû à l'inhibition de la synthèse des prostaglandines par inactivation de la cyclo-oxygénase 1 et 2 (COX-1 et COX-2), (Prescott et Fitzpatrick, 2000). Cependant, l'importance de l'inhibition de la COX pour les effets anti-prolifératifs par AINS est controversée à l'heure actuelle. La concentration des AINS qui sont nécessaires pour une inhibition de croissance sont 10 Yin et al. 1998). Dans cette étude, nous nous sommes concentrés sur une voie de signalisation impliquée dans l'initiation du cancer colorectal, car les AINS ont été signalés pour prévenir ou ralentir la tumorigenèse plutôt que de réduire la croissance des cancers avancés. Pratiquement tous les cancers du côlon surviennent au sein des adénomes ou des zones de dysplasie pré-existants. Les voies de signalisation qui régulent et coordonnent la croissance, la différenciation et l'apoptose des cellules épithéliales de la muqueuse du côlon ont été largement étudiées (pour une revue, voir Ilyas et al., 1999). L'accumulation des données indique que la voie de signalisation caténine / TCF joue un rôle clé dans la régulation de ces mécanismes. Des mutations dans le APC ou - gène caténine composants codent de la caténine / TCF-voie initient le développement de presque tous les cancers du côlon humain. De type sauvage APC dans un complexe avec axine et glycogensynthase kinase 3 (GSK 3) cibles caténine pour la dégradation, ce qui maintient un faible niveau de caténine dans les cellules normales (revue dans Polakis et al., 1999). Dans les cellules tumorales colorectales, la perte de fonction des résultats d'APC dans l'augmentation des niveaux de ß-catenine. Les niveaux élevés de ß-catenine favoriser son interaction avec des facteurs de transcription de la famille TCF-Lef et la translocation de la ß-catenine / TCF-complexe dans le noyau où il module la transcription de gènes en aval (Behrens et al., 1996; Pennisi, 1998), à-dire c - myc (He et al., 1998) et de la cycline D1 (Shtutman et al 1999;. Tetsu et McCormick, 1999), ce qui pourrait être impliqué dans la tumorigenèse. Dans la présente étude, nous avons examiné les effets de la drogue anti-inflammatoires de l'aspirine et l'indométhacine sur caténine mécanismes de signalisation dans les cellules CRC. Nous présentons des preuves que l'activité transcriptionnelle du complexe ß-catenine / TCF est fortement inhibée par les AINS, sans affecter la quantité totale de ß-catenine et / ou TCF-4. La régulation de la caténine / TCF-activité par l'aspirine et l'indométhacine Pour examiner l'activité de TCF dans des lignées cellulaires CRC, nous avons utilisé des constructions de gènes rapporteurs contenant trois copies d'un élément de TCF contraignant soit optimisé ou mutant, respectivement, en amont d'un promoteur fos c - minimal, entraînant le gène de la luciférase (Korinek et al., 1997). L'aspirine et l'indométhacine n'a eu aucun effet sur le promoteur fos c - seul, qui a été déterminée en analysant l'expression fos c - en utilisant un dosage RT-PCR semi-quantitative (données non représentées). les cellules SW948, qui présentent un niveau élevé de catenine / TCF à médiation de transcription due à une mutation d'APC inactivant (Dihlmann et al., 1999) ont été transfectées avec les constructions rapporteurs et ensuite traité avec les AINS. La figure 1a montre une diminution dose-dépendante de l'activité de TCF lors d'un traitement avec de l'aspirine ou de l'indométhacine. Les effets de ces agents sur la viabilité des cellules CRC ont été largement étudiés et les concentrations de 1 à 50% de celle des cellules témoins. La même réduction a été obtenue à l'aide de 200 M indométacine. Les AINS ont également réduit l'expression de la luciférase à partir d'une construction rapporteur contenant les éléments Tcf en combinaison avec un promoteur minimal de SV40 (données non présentées). Une étape critique dans l'activation TCF est son interaction avec caténine. Déterminer, si l'aspirine et l'indométhacine confèrent leur effet inhibiteur en amont ou en aval de la signalisation de la ß-catenine, on a cotransfecté un mutant de la ß-catenine (résidu d'acide aminé suppression Ser45) constitutivement actif conjointement avec la construction rapporteurs dans des cellules SW948. Conformément aux rapports précédents (Morin et al., 1997), l'activité de TCF augmenté de manière significative lors de l'expression de la ß-catenine mutée (figure 1b). En revanche, tous les deux, l'aspirine et l'indométhacine ont réduit l'augmentation de l'activité du TCF à un niveau pratiquement de base (figure 1b), ce qui suggère que ces médicaments peuvent inhiber la ß-catenine lui-même ou des composants en aval, plutôt que des régulateurs en amont de la ß-catenine / TCF voie. Etant donné que l'activation du TCF peut être modulée par le niveau de la ß-catenine qui est régulée par la dégradation, nous avons analysé la quantité totale de la ß-catenine en réponse à l'aspirine ou le traitement indométhacine, respectivement. Comme cela est représenté par immunoempreintes (figure 1c), aucun médicament affecté le niveau catenine totale. En outre, aucune des bandes supplémentaires, ce qui représente des produits de dégradation catenine ont été observés dans des lysats de cellules traitées par les AINS par rapport aux témoins. Par conséquent, il semble peu probable que l'aspirine et l'indométhacine médiatisent leur effet inhibiteur en séquestrant des caténine. L'aspirine et l'indométacine modulent - caténine / activité TCF indépendamment de la COX-2 Pour élucider davantage la spécificité de l'aspirine et l'indométhacine sur l'inhibition de la voie de la ß-catenine / TCF, nous avons analysé l'activité du TCF dans des lignées cellulaires CRC supplémentaires de contexte génétique différent. SW480 et SW948 n'expriment la COX-2 (Smith et al, 2000;. Nos données). En outre, SW480, comme SW948 abrite une mutation APC tronquant, conduisant à des niveaux élevés d'activité transcriptionnelle dépendante TCF (Korinek et al., 1997). Les lignées de cellules LoVo CRC et HCT116 sont dérivées de tumeurs du phénotype instabilité des microsatellites (MSI). En outre, les cellules expriment une LoVo APC tronquées, tandis que HCT116 a été montré pour contenir une forme mutante du TCF-activation de la ß-catenine (suppression d'acides aminés Ser45; Rowan et al 2000;.. Morin et al, 1997). Comme le montre la figure 2. l'aspirine et son principal métabolite salicylate de réduction de l'activité de TCF dans les quatre lignées cellulaires à niveau de base, comparable à celle, obtenus avec le journaliste TCF-non-réactif (pFOP). Des résultats équivalents ont été obtenus lorsque les cellules ont été traitées avec l'indométacine. En revanche, la dexaméthasone, un glucocorticoïde anti-inflammatoire synthétique, qui inhibe la COX-2 expression à des doses de 10-10 à 10-6 M (. Goppelt-Struebe et al 2000) n'a pas réussi à affecter l'activité de TCF soit dans la lignée cellulaire, même à des concentrations plus élevées (10-5 M). Ensemble, ces résultats indiquent que les effets inhibiteurs de l'aspirine et l'indométacine pourraient ne pas dépendre de la COX-2 l'activité et semblent être indépendants du type de mutation responsable de la régulation positive de caténine / signalisation TCF. Expression de caténine / TCF de transcription cibles est inhibée par les AINS Les résultats ci-dessus suggèrent que la transcription du / TCF-4 gènes régulés de caténine est supprimée par les AINS à travers un mécanisme indépendant du niveau caténine. Pour confirmer les résultats obtenus par les analyses de luciférase reporter, nous avons analysé l'expression de la cible de la cycline D1 TCF récemment décrit ci-après le traitement de l'aspirine ou l'indométacine. Etant donné que le niveau de la cycline D1 d'expression est dépendant du cycle cellulaire, les cellules ont été privées de sérum pour la synchronisation avant le traitement par AINS. l'analyse semi-quantitative RT-PCR a révélé que l'aspirine et l'indométhacine ont réduit de manière significative la cycline D1 expression de l'ARNm dans les quatre lignées cellulaires testées CRC (figure 3a). Au bout de 24 h, le traitement par AINS soit a été associée à une diminution dépendante de la concentration de la cycline D1 transcription d'actine, contrairement transcription qui est restée inchangée. Cohérentes avec les données d'ARNm, la cycline D expression de la protéine a diminué en réponse à l'aspirine et l'indométhacine, ainsi qu'il ressort de l'analyse Western Blot de SW948 et SW480 cellules (figure 3b). Le niveau de la protéine TCF-4 n'a pas été affectée par l'une ou l'autre médicament, ce qui exclut la possibilité que les AINS médient leurs effets répressifs en réduisant la quantité du facteur de transcription TCF-4. la localisation subcellulaire de la ß-catenine est pas affectée par le traitement par AINS Les modèles actuels proposent que l'accumulation de caténine nucléaire pourrait être responsable de TCF-activation (Korinek et al., 1997). Nous avons donc envisagé la possibilité que la régulation négative de l'expression du gène cible sensible au Tcf en réponse aux AINS peut être provoquée par des changements dans la localisation subcellulaire de la ß-catenine. Nous avons déterminé la distribution catenine lors d'un traitement par AINS coloration par immunofluorescence indirecte dans les lignées cellulaires du CRC (SW948, SW480, HCT116, LoVo). Pour correspondre à ces expériences avec notre précédente analyse de l'expression du gène cible, toutes les lignées cellulaires ont été synchronisées par le sérum privation avant l'addition des médicaments. Comme cela est illustré sur la figure 4. aucune corrélation entre la localisation subcellulaire de la ß-catenine endogène et le TCF-4 activité observée a été observée. cellules témoins non traitées SW480, qui présentent la plus forte activité ß-catenine / TCF-4 parmi les quatre lignées cellulaires testées (voir la figure 2), a montré une forte coloration nucléaire et cytoplasmique de la ß-catenine (figure 4a). Ni l'aspirine, ni indométacine eu aucun effet sur la distribution ou de l'intensité de la coloration caténine même en présence de concentrations les plus élevées (figure 4b, c). Incubation des cellules SW948 avec 400 M indométacine est hautement toxique et a entraîné le détachement et la perte de la plupart des cellules. Cependant, semblable à SW480 cellules, traitement par AINS des cellules SW948 n'a pas été associée à des changements dans le modèle diffus cytoplasmique caténine de coloration dans les cellules restantes (Figure 4d l). La liaison du / TCF-4-catenine complexe à son élément de réponse ADN L'effet inhibiteur de l'aspirine et l'indométhacine sur l'activité transcriptionnelle du complexe ß-catenine / TCF-4 peut se produire par la rupture de la ß-catenine / TCF-4 complexe lui-même ou par une perturbation de son interaction avec l'ADN. Nous avons donc demandé si l'aspirine ou l'indométacine peuvent affecter la liaison du complexe caténine / TCF-4 à ses éléments d'ADN-réponse. des extraits nucléaires provenant de cellules traitées avec le médicament ont été analysés par des dosages de décalage de mobilité électrophorétique quant à leur capacité à interagir avec les 32 fragments d'ADN marqués au P contenant des éléments de réponse du TCF. La figure 5 montre le résultat d'un essai de gel-shift représentant pour analyser caténine / TCF formation complexe non traitée et de l'aspirine traitée SW948 cellules. Les bandes observées dans les voies 1 9). La liaison des complexes de TCF à leur région de liaison spécifique n'a pas été affectée par le traitement à l'aspirine des cellules SW948 (Figure 5. Les voies 2 et 3). De même, aucun effet sur l'interaction ADN-TCF complexe a été observée dans les cellules SW480, ni lorsque les cellules ont été traitées avec des quantités de plus en plus indométacine (données non représentées). Ainsi, l'activité de transcription réduite des complexes (figures 1 et 2) n'a pas pu être attribuée à une diminution de leur capacité de liaison à des éléments d'ADN réactifs. mécanismes moléculaires multiples semblent être impliqués dans les tumeurs des effets suppresseurs des AINS. La présente étude a pour la première fois fournit des preuves que la voie de la ß-catenine / TCF-4 signalisation est une cible de médicaments anti-inflammatoires de l'aspirine et l'indométhacine dans les cellules CRC. Comme indiqué par la régulation d'un gène rapporteur TCF-réactif et de l'endogène cible cycline TCF régulée D1 (Shtutman et al 1999;. Tetsu et McCormick, 1999) ces médicaments pourraient antagoniser l'activation des mécanismes de signalisation induites par des mutations dans les composants de la sentier. Bien que plusieurs gènes ont été décrits pour être activés par le / TCF-4 complexe caténine (He et al 1998. 1999;. Mann et al 1999;. Shtutman et al 1999;. Tetsu et McCormick, 1999), les conséquences de la hausse ou à la régulation de l'caténine / TCF-voie ne sont pas complètement compris. En particulier, la liaison entre la voie de signalisation et de régulation de l'apoptose est incertaine. Dans la plupart des cellules CRC la voie est constitutivement active à un niveau élevé en raison d'APC défectueux ou fonctions caténine. Reconstitution de type sauvage dans les cellules APC CRC exprimant seulement mutant endogène APC down-régule caténine / TCF-activité par la dégradation de la caténine (Korinek et al., 1997) et stimule l'apoptose (Morin et al., 1996). De même au type sauvage APC, la plupart des AINS induisent l'apoptose dans les cellules CRC (Shiff et al 1995;. Ricchi et al 1997;.. Chan et al 1998). Nous pouvons maintenant démontrer que les deux AINS, l'aspirine et l'indométhacine, également régulent le TCF-activité, réduisant ainsi la transcription des gènes cibles. En revanche, le butyrate et le sulindac, à savoir les deux inducteurs de l'apoptose dans les cellules CRC, ont été récemment montré à induire la ß-catenine / TCF-voie (Bordonaro et al., 1999). Ensemble avec nos résultats, cela signifie, que l'initiation de la cascade apoptotique est pas directement attribuables à la modulation du TCF-activité. Bien que les conclusions tirées des résultats avec différents AINS sont contradictoires, ils démontrent clairement qu'il existe un lien entre les effets des agents de chimioprévention et TCF-4 activité caténine /. Nous avons donc mis l'accent sur elle-même caténine comme un régulateur majeur de la transcription TCF sensible pour être une cible de l'aspirine et de l'action indométacine. Aucune réduction du niveau caténine a été observée lors d'un traitement avec de l'aspirine ou l'indométacine, exclure la possibilité que l'interférence des agents avec la transcription TCF-dépendante a été médiée par la régulation de la quantité totale de caténine. Alors que notre analyse de l'expression ont été réalisées dans des lignées cellulaires, plusieurs études ont abordé la expression et la localisation subcellulaire de la ß-catenine en réponse au traitement par AINS chez des modèles animaux in vivo par l'analyse immunohistochimique des adénomes. Dans Min / + - souris, qui sont prédisposés à développer de multiples adénomes intestinaux dus à une mutation germinale Apc, l'aspirine et les AINS sulindac produit une diminution de la caténine intracellulaire (Mahmoud et al 1997. 1998.). McEntee et al. (1999) ont signalé un niveau réduit catenine dans les petites tumeurs intestinales après 2 et 4 jours de traitement sulindac, tandis que dans des tumeurs provenant d'animaux traités pendant 20 jours, catenine niveaux ne sont pas significativement différents des témoins non traités (McEntee et al., 1999) . En outre, de haute coloration caténine dans les tumeurs du côlon de la souris Min n'a pas été affectée par le traitement par AINS. Ce décalage entre notre analyse in vitro et dans certaines des études in vivo concernant les niveaux caténine en réponse aux AINS reste à élucider. Il convient de noter que la régulation du niveau caténine ne précède pas nécessairement les effets sur l'activité transcriptionnelle. Récemment, on a montré que, avec un pourcentage croissant de l'apoptose catenine est traitée par la caspase-3 (Webb et al., 1999). Par conséquent, les taux réduits caténine observés in vivo semble plutôt être le résultat de l'apoptose qui suit en aval des effets induits par les AINS. En accord avec nos résultats obtenus avec quatre AINS traités lignées cellulaires CRC in vitro. aucun changement dans la distribution intracellulaire de caténine a été impliqué in vivo. Bien que l'activité transcriptionnelle du complexe caténine / TCF-4 est régulée à la baisse par l'aspirine et l'indométacine, nous ne détectons des altérations de la capacité de liaison à l'ADN du complexe. Par conséquent, nous pensons que, en réponse à un traitement AINS, ce complexe est fonctionnellement inactive en raison de modifications post-traductionnelles, à savoir l'état de phosphorylation de caténine et / ou TCF-4. Outre plusieurs sites Ser / Thr-phosphorylation impliquées dans la dégradation de la protéine, caténine héberge des sites Tyr-phosphorylation, qui mettent en cause la diaphonie avec d'autres voies de signalisation (Hoschuetzky et al, 1994;. Aicher et al., 1997). Que Tyr-phosphorylation de caténine est directement visé par les AINS reste à déterminer. En variante, des cofacteurs, qui sont nécessaires pour l'induction de la transcription sensible au Tcf peuvent être inactivés en réponse aux AINS. Récemment, il a été signalé que l'activité transcriptionnelle du complexe / TCF de caténine est régulée par la liaison du cofacteur de transcription CREB-binding protein (CBP) à caténine (Hecht et al 2000;. Takemaru et la Lune, 2000). En outre, l'acide salicylique et de l'aspirine ont été rapportés pour réprimer la phosphorylation de la protéine de liaison à l'élément de réponse à l'AMPc (CREB) (Stevenson et al., 1999), inhibant ainsi la transcription dépendante de CREB. Ensemble, ces résultats soutiennent la présomption que la phosphorylation de caténine pourrait être affectée de façon similaire par les AINS. Enfin, la co-répresseurs du complexe peuvent être activés par l'aspirine et l'indométhacine. En résumé, nous avons identifié caténine / transcription TCF-médiation comme une cible d'action AINS, même si le mécanisme par lequel l'aspirine et l'indométhacine inhibent TCF-activité reste à établir. Les résultats actuels pourraient aider à expliquer certaines fonctionnalités de chimioprévention AINS médiée. Il est possible, que les différents gènes en aval Tcf sont réglementés par de grands complexes coactivateur / répresseurs distincts dont caténine et TCF-4. Les expériences futures vont dire quels composants de ces complexes sont affectés par les AINS et si les AINS sélectifs peuvent jouer un rôle dans les futures stratégies de chimioprévention. Matériaux et méthodes Les lignées cellulaires et les drogues lignées cellulaires CRC humaines (SW480, SW948, LoVo, HCT116) ont été tirées de la collection de la tumeur du Centre allemand Cancer Research (Tumorbank, DKFZ, Heidelberg). Les médicaments anti-inflammatoires non stéroïdiens (AINS), l'aspirine (acide acétylsalicylique d'; ASA), le salicylate de sodium (Na-Sal), l'indométacine et la dexaméthasone ont été achetés auprès de Sigma, Allemagne. M M cinquante solutions mères de l'aspirine et le salicylate de sodium ont été préparées dans du milieu RPMI 1640 et ajusté à un pH de 7 à 7,5 par du Tris. Indométacine a été dissous dans de l'acétone à une solution stock M 10 m. Dans toutes les expériences de contrôle de l'acétone ont montré aucun effet significatif. Dexamethasone a été dissous dans du PBS. Les cellules ont été cultivées dans du milieu RPMI 1640 (Gibco, BRL, Life Technologies, Inc.) supplémenté avec 10% de FCS, 100 U / ml de pénicilline et 100 ug / ml de streptomycine. Toutes les lignées cellulaires ont été cultivées à 37 ° C dans une atmosphère humidifiée de 5% de CO 2. Les cellules ont été repiquées en utilisant une solution de trypsine / EDTA 0,25%. Pour les expériences de synchronisation du cycle cellulaire, les cellules ont été privées de sérum pendant 24 h par incubation dans du milieu RPMI 1640 sans SVF. Transfection et journaliste tests génétiques La transfection transitoire a été réalisée en utilisant le réactif de transfection SuperFect (QIAGEN, Hilden, Allemagne) comme décrit précédemment (Dihlmann et al., 1999). En bref, 10 6 cellules ont été transfectées avec 3 g de constructions de rapporteur de la luciférase (ou PTOP pFOP, respectivement) et 1 g de pRSV-LacZ pour la normalisation. Pour l'expression de caténine mutant, a été inclus 1 g de pCMV 45, comme indiqué. Les AINS ont été ajoutés 3 h après la transfection. Les cellules ont été mises en incubation pendant 24 heures, lysées dans un tampon Tris-PO 4 - luciferase-tampon et ont été recueillies pour des dosages de luciférase et l'activité galactosidase, respectivement, comme décrit précédemment (Dihlmann et al., 1999). Le journaliste de TCF-réactif construit pTOPFLASH et pFOPFLASH ont été aimablement fournies par H Clevers; Université d'Utrecht, Pays-Bas. Contrôle plasmide pRSV--lacZ a été obtenu à partir de DKFZ Heidelberg, en Allemagne. Le plasmide d'expression pCMV 45Cat, contenant un ADNc caténine mutant a été aimablement fourni par KW Kinzler (Johns Hopkins Oncology Center, Baltimore, MD, USA). Les cellules ont été ensemencées sur des plaques de culture tissulaire (Roth, Karlsruhe, Allemagne) à une densité de 10 5 cellules / cm 2 et cultivées dans un milieu RPMI 1640 pendant une nuit. Suite à la privation de sérum pendant 24 h, des monocouches ont été traitées pendant 24 h avec de l'aspirine (0, 1, 2, 5, 10 m M) ou l'indométacine (100, 200, 400 M), respectivement. Les cellules ont été fixées dans du methanol à -20 Sigma, Allemagne) pour une coloration nucléaire. Les cellules ont été traitées par des AINS, comme indiqué dans les légendes des figures. Des extraits protéiques ont été préparées dans un tampon RIPA (50 mM de Tris-HCl, pH 7,5, 150 mM de NaCl, désoxycholate de sodium à 0,5%; 0,1% de SDS, 0,5% de NP-40) complété par un inhibiteur de protéinase cocktail (TM complet sans EDTA; Boehringer Mannheim, Allemagne) et on le dissout dans un tampon d'échantillon de Laemmli. Vingt microgrammes de protéines totales ont été fractionnés par SDS Upstate Biotechnology) et l'actine (ICN Biomedicals). On a utilisé de lapin anti-IgG de souris de peroxydase (Dako GmbH, Hambourg, Allemagne) comme anticorps secondaire conjugué à la visualisation des protéines par ECL (Amersham-Pharmacia, Freiburg, Allemagne). ARN et RT-PCR isolement L'ARN total a été isolé à partir des cellules en utilisant la méthode décrite par Chomczynski et al. (1987). Pour la synthèse d'ADNc, 5 g d'ARN total ont été inclus dans un volume réactionnel de 20 litres en utilisant des amorces hexamères et transcriptase inverse Superscript II (Gibco nchen, Allemagne). Gel retard sur gel Les cellules ont été traitées avec de l'aspirine à des concentrations de 0, 5 ou 10 m M. respectivement pendant 24 h. Des extraits nucléaires ont été préparés comme décrit par Schreiber et al. (1989). Le 82 pb à double TOP - brin ou FOP-oligonucléotides ont été excisées à partir du plasmide pTOPFLASH ou pFOPFLASH respectivement par Sal I endonucléase de restriction. Une centaine ng de chaque oligonucléotide ont été endlabeled avec 50 Ci de 32P-ATP en utilisant 10 U de T4 polynucleotide kinase (PNK, New England Biolabs) à 37 ° C pendant 1 h, et purifié avec un kit d'extraction de nucléotides (QIAGEN, Hilden, Allemagne ). Les oligonucléotides marqués ont été ajustés à 10 000 c. p.m./ l. Pour les compétitions, un excès molaire de 30 fois de l'oligonucléotide non marqué a été utilisé. Les réactions de liaison ont été effectuées en utilisant un kit de BandShift (Amersham Pharmacia, Freiburg, Allemagne) dans un tampon de liaison (40 mM de Tris-HCl (pH 7,5), 200 mM de NaCl, 2 mM de DTT; 2,5% de glycerol, 0,05% de NP-40 ; 0,25 g / ml Poly (DIDC), 5 m m MgCl 2). Les mélanges réactionnels, chacun contenant 10 g d'extraits nucléaires et 2 l de la sonde d'ADN marquée au 32P ont été incubées pendant 20 min à température ambiante, et ensuite séparés sur une AAP-gel à 5% dans TBE-tampon (89 mM de Tris - borate, pH 8,0; 89 m m d'acide borique, 1 mM d'EDTA) à 4 ° C. Aicher B, Lerch MM, Muller T, Schilling J et Ullrich A. (1997). J. Cell Biol. 138, 681 696. MEDLINE Behrens J, von Kries JP, Kuhl M, Bruhn L, Wedlich D, Grosschedl R et Birchmeier W. (1996). Nature 382, ​​638 642. MEDLINE Bordonaro M, Mariadason JM, Aslam F, Heerdt BG et Augenlicht LH. (1999). Cell Growth Differ. 10, 713 720. MEDLINE Chan TA, Morin PJ, Vogelstein B et Kinzler KW. (1998). Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 681 686. MEDLINE Dihlmann S, Gebert J, Siermann A, C et Herfarth von Knebel Doeberitz M. (1999). Cancer Res. 59 1857 1860. MEDLINE DuBois RN et Smalley WE. (1996). J. Gastroenterol. 31, 898 906. MEDLINE Goodman LS, Gilman AG, Hardman JG et Limbird LE. (1996). ). La base de Pharmarcological Therapeutics. JG Hardman et Limbird LE. (Ed.). McGraw-Hill, Division des professions de la santé:. New York, Goppelt-Struebe M, Rehm M et Schaefers HJ. (2000). Cambre. Pharmarcol. 361, 636 645. Hanif R, Pittas A, Feng Y, Koutsos MI, Qiao L, Staiano-Coico L, Shiff SI et Rigas B. (1996). Biochem. Pharmacol. 52, 237 245. L'article MEDLINE Il TC, Chan TA, Vogelstein B et Kinzler KW. (1999). Cellule 99, 335 345. MEDLINE Il TC, Sparks AB, Rago C, Hermeking H, Zawel L, da Costa LT, Morin PJ, Vogelstein B et Kinzler KW. (1998). Sciences 281 1509 1512. MEDLINE Hecht A, Vleminckx K, Stemmler MP, van Roy F et Kemler R. (2000). EMBO J. 19 1839 1850. MEDLINE Herrmann C, Bloc C, Geisen C, Haas K, Weber C, Winde G, Moroy T et Muller O. (1998). Oncogene 17 1769 1776. MEDLINE Hoschuetzky H, H et Aberle Kemler R. (1994). J. Cell Biol. 127 1375 1380. MEDLINE Ilyas M, Straub J, Tomlinson IP et WF Bodmer. (1999). EUR. J. Cancer 35, 335 351. MEDLINE Korinek V, Barker N, Morin PJ, van Wichen D, de Weger R, Kinzler KW, Vogelstein B et Clevers H. (1997). Sciences 275 1784 1787. Article MEDLINE Mahmoud NN, Boolbol SK, Bilinski RT, Martucci C, Chadburn A et Bertagnolli MM. (1997). Cancer Res. 57, 5045 5050. MEDLINE Mahmoud NN, Dannenberg AJ, Mestre J, Bilinski RT, Churchill MR, Martucci C, Newmark H et Bertagnolli MM. (1998). Chirurgie 124, 225 231. MEDLINE Mann B, Gelos M, Siedow A, Hanski ML, Gratchev A, Ilyas M, WF Bodmer, Moyer MP, Riecken EO, Buhr HJ et Hanski C. (1999). Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96, 1603 1608. Article MEDLINE Morin PJ, Sparks AB, Korinek V, Barker N, Clevers H, Vogelstein B, Kinzler KW. (1997). Sciences 275 1787 1790. Article MEDLINE Morin PJ, Vogelstein B et Kinzler KW. (1996). Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 7950 7954. Article MEDLINE Patter EJ et DeLong MJ. (1999). Lett cancer. 147, 95 100. MEDLINE Polakis P, Hart M et Rubinfeld B. (1999). Adv. Exp. Med. Biol. 470, 23 32. MEDLINE Prescott SM et Fitzpatrick FA. (2000). Biochim. Biophys. Acta 1470, M69 M78. MEDLINE Ricchi P, Pignata S, Di Popolo A, Memoli A, Apicella A, Zarrilli R et Acquaviva AM. (1997). Int. J. Cancer 73, 880 2-7 "> Article MEDLINE Rowan AJ, Lamlum H, Ilyas M, Wheeler J, Straub J, Papadopoulou A, Bicknell D, WF Bodmer et Tomlinson IP. (2000). Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97, 3352 3357. Article MEDLINE R 11306. MEDLINE Schreiber E, Matthias P, Muller MM et Schaffner W. (1989). Nucleic Acids Res. 17, 6419. MEDLINE Shiff SJ, Qiao L, Tsai LL et Rigas B. (1995). J. Clin. Investir. 96, 491 503. MEDLINE Shtutman M, Zhurinsky J, Simcha I, Albanese C, D'Amico M, Pestell R et Ben Ze'ev A. (1999). Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96, 5522 5527. Article MEDLINE Smith ML, Hawcroft G et Hull MA. (2000). EUR. J. Cancer 36, 664 674. MEDLINE Stevenson MA, Zhao MJ, Asea A, Coleman CN et Calderwood SK. (1999). J. Immunol. 163, 5608 5616. MEDLINE Subbegowda R et Frommel TO. (1998). Cancer Res. 58, 2772 2776. MEDLINE Takemaru KI et la Lune RT. (2000). J. Cell Biol. 149, 249 254. MEDLINE Webb SJ, Nicholson D, Bubb VJ et Wyllie AH. (1999). FASEB J. 13, 339 346. MEDLINE La figure 1 L'aspirine et l'indométhacine dose-dépendante inhibent la transcription de la luciférase du gène rapporteur TCF-4-réactif. (A) les cellules SW948 ont été co-transfectées avec des plasmides rapporteurs luciférase hébergeant des sites de TCF-4 de liaison (TOP) ou un site de TCF-liaison mutant (FOP), respectivement et lacZ expression plasmidique pCMV-lacZ. (B) des cellules SW948 ont été co-transfectées avec les plasmides rapporteurs (haut, FOP, pCMV-LacZ) et des vecteurs d'expression pour la ß-catenine mutante (45). (A et b) Trois heures après la transfection, les montants de l'aspirine ou de l'indométhacine, on a ajouté de plus en plus, comme il est indiqué. activités luciférase ont été déterminées 24 heures après transfection, normalisé par rapport aux valeurs de l'activité galactosidase correspondante et exprimées en activation fois par rapport à des cellules non traitées transfectées. Moyenne des résultats de deux expériences répétées effectuées dans les doubles. Les barres indiquent les écarts-types. (C) Les lysats cellulaires (20 g / voie) des cellules transfectées ont été soumises à une analyse immunoblot contre la ß-catenine. Pour démontrer le chargement équivalent des lignes, le transfert a été dépouillé et Western-blot avec un anticorps anti-actine a été réalisée La figure 2 SW948, SW480, LoVo et les cellules HCT116 ont été transfectées avec des plasmides rapporteurs (TOP / FOP, pCMVlacZ) et comme décrit dans `Matériels et méthodes». Les cellules ont ensuite été traitées soit avec 5 m M aspirine (ASA), 5 m salicylate M de sodium (Na-Sal), 100 M (LoVo; HCT116) / 200 M (SW948, SW480) indométacine (Indo) ou avec 10 M dexaméthasone ( dex) pendant 24 h. L'activité de transcription relative a été déterminée comme décrit précédemment Figure 3 Expression de la caténine / TCF-4-réactif cible cycline D1 est downregulated par l'aspirine et l'indométacine. (A) semi-quantitative RT HCT116 et LoVo. La cycline D1 et l'expression de l'actine en réponse à un traitement de 24 h avec de l'aspirine (0, 5, 10 m M) et indométhacine (200, 400 M) est signalée. Le niveau relatif d'expression de la cycline D1 a été déterminée par densitométrie comme le rapport de l'intensité de la cycline D1 à l'intensité de l'actine correspondante et comparée aux valeurs des cellules non traitées. (B) l'analyse western blot avec des anticorps contre la cycline D1 ou TCF-4 ont été effectués sur des lysats de cellules entières préparés à partir des cellules synchronisées traitées avec la quantité d'aspirine ou de l'indométhacine indiquée. Le transfert a été enlevé et Western-blot avec un anticorps anti-actine a été effectuée pour démontrer le chargement équivalent des lignes La figure 4 de la distribution subcellulaire de la ß-catenine en réponse à l'aspirine (ASA) et l'indométhacine (indo). SW948, SW480, LoVo et HCT116 cellules cultivées sur des lames, ont été privées de sérum pour la synchronisation et ensuite traités avec 1% d'acétone dans du PBS (a. D. G et j), 5 m M aspirine (n. E. H et k) ou 400 M indométacine (c. f. i et l). Les cellules ont été fixées, perméabilisées et colorées avec un anticorps anti-caténine pour l'analyse par immunofluorescence indirecte. Les lames ont été photographiées à 400 La figure 5 liaison de la ß-catenine / TCF-complexes à des éléments de TCF-contraignants dans les cellules SW948 n'a pas été affectée par le traitement des cellules avec l'aspirine. des essais de décalage de gel ont été effectuées avec des quantités égales d'extraits nucléaires de non traitées ou traitées (5 ou 10 m M; aspirine ASA) cellules. Les pistes 1, 2 et 3 sont les résultats de la liaison à une région de liaison de TCF-32 marqué au P optimale. Les pistes 4, 5 et 6 ont été obtenus avec une région de liaison à TCF muté marqué au 32P. Lanes 7, 8 et 9 montrent qu'un excès de 30 fois de la région non marquée de TCF liaison optimale utilisée comme un concurrent empêche la liaison de l'caténine et TCF-complexes dans la région TCF liaison. Un gel représentant des expériences indépendantes, qui montre un schéma similaire de complexes protéine / ADN est montrée